В годы Великой Отечественной войны этот учебный биплан встал на защиту Родины, его переделали в небольшой ночной бомбардировщик. Бомбовая загрузка По-2 составляла 350 килограммов. 

В задней кабине установили стрелковую точку с пулемётом. Во время войны действовало несколько авиационных полков с этими бомбардировщиками, в ночное время они тихо и неспешно наносили бомбовые удары по переднему краю вражеских войск и ближним тылам противника.

Конструкция самолёта получилась настолько удачной, что делалось множество вариантов самого разностороннего назначения. Имелись среди них сельскохозяйственные самолёты для опыления посевов, связные, штабные, санитарные, для аэрофотосъёмки, пассажирские (причём производились самолёты даже с салоном класса люкс), поплавковые и большое число различных экспериментальных вариантов.

По-2 строили серийно до 1935 года, а эксплуатация этого биплана продолжалась ещё долго. Всего было построено более 33 000 самолётов этой марки.